小溪突然袭来的新冠肺炎疫情让人类又一次见识了“病毒”的威力。肉眼看不到的病毒作为一个物种，很可能从地球生命诞生之初就已经存在，而人类从意识到有病毒存在→看到病毒的模样→弄清病毒的内部结构成分却经历了漫长的过程。20世纪30年代发明了电子显微镜才使在光学显微镜下根本找不到的微小病毒现出了真身。其实，电子显微镜最早的思路来自一个“物质波假说”。20世纪中期发明的X射线晶体衍射技术，最先也来自一个“突发奇想”，清晰的三维重建图像显露出病毒的精细结构。而科学家们仍然没有满足，他们期待能更深入地了解病毒复制、致病的过程，期待有更先进的技术来探索微观世界的奥秘。20世纪后期，迎来了多种新型高分辨率显微技术喷发式发展的年代，纵观这些发明，最先大多来自“离奇”的想法，某些看来不可能实现的事最终却获得了成功。“异想天开”本是形容胡思乱想的贬义词，而科学的发展却证明了有“异想”才可能“天开”，独特的思路有可能使奇迹出现！·颠覆传统20世纪70年代末，电子显微镜虽然比光学显微镜分辨率高，但仍不能清楚地看到单个原子。IBM公司瑞士苏黎世实验室的杰德·宾宁(GerdBinning)与海因里希·罗勒(HeinrichRohrer)都对原子表面的研究十分着迷，但因现有电子显微镜的性能限制，无法直接探索原子表面的结构。宾宁与罗勒为此感到困惑，最终决定自己动手研制一种能在纳米级水平上观察和操纵原子的新设备。他们了解到量子学中有一种量子隧道效应：原子会从固体的表面逃逸而形成悬浮在固体表面上方的“云”，当另一个固体表面靠近时，两者的原子云会重叠，这样就会发生原子的交换。宾宁与罗勒的“异想”由此产生：能否用量子隧道效应来探测原子的表面结构呢？这与传统的显微镜概念已完全不符，他们自己也没想到，因为这个“异想”竟有了一项重要的发明。他们的设想是：用一个原子尺度的探针在被分析物体的表面扫描，当探针距物体表面非常接近(约纳米级距离)时会发生量子隧道效应：电子穿过物体与探针间的空隙形成微弱电流，探针与物体的距离只要发生微小变化，产生的电流就会相应改变，精确测量所获的电流值就应能描述出物体表面的形状。研制的过程非常艰辛，宾宁与罗勒对最初的设计进行了一系列的改进和调整，提高整个系统的精度，以达到在如此微小的尺度上获得精确测量结果的目的。年，他们终于获得了成功。宾宁、罗勒发明的扫描隧道显微镜(ScanningTunnelingMicroscope，简称STM)(也称为扫描探针显微镜)用一个细小的探针扫描一个原子，可细致地描绘出该原子的轮廓，并依据测得的电流波动值绘出清晰的单个原子图像，分辨率达0.01纳米(病毒的大小为20~纳米)。这使研究者第一次有机会进入单个原子和分子的纳米级世界，该装置还可操纵单个原子的推拉，人类对微观世界的探索由此提升到一个全新的水平。(宾宁、罗勒与50多年前发明电子显微镜的恩斯特鲁斯卡(ErnstRuska)分享了年诺贝尔物理学奖)杰德宾宁(GerdBinning)、海因里希罗勒(HeinrichRohrer)(图片来自网络)扫描隧道显微镜原理示意图(图片来自网络)罗勒(左)、宾宁(右)与他们研制的第一代扫描隧道显微镜(年)(图片来自网络)新型的扫描隧道显微镜(年)(图片来自网络)不同年代扫描隧道显微镜所获图像的对比(图片来自网络)扫描隧道显微镜只能测导体和部分半导体样品，宾宁再接再厉，年又与卡尔文·奎特(CalvinQuate)、克里斯托夫·格伯(ChristophGerber)发明了另一类型的扫描探针显微镜——原子力显微镜(AtomicForceMicroscope，简称AFM)。原子力显微镜的原理是利用微小悬臂来感受、放大悬臂上极尖细的探针与受测样品原子间的作用力，从而达到具有原子级分辨率的检测结果。原子力显微镜既可以测金属样品外还可测非金属样品，从而弥补了扫描隧道显微镜的不足。卡尔文奎特(CalvinQuate)、克里斯托夫格伯(ChristophGerber)(图片来自网络)原子力显微镜原理示意图(图片来自网络)原子力显微镜属于非破坏性和非侵入性的成像技术，以非常高的分辨率将微生物的复杂结构可视化。用原子力显微镜可观察病毒颗粒的形态、研究病毒的表面特性、识别病毒衣壳内部蛋白质的排列、观察细胞被病毒感染的生物过程等。这对快速、准确地识别病毒，了解病毒内部的结构十分有利，在流行病学及临床治疗研究中具有重要的意义(宾宁、奎特与格伯获得了年科维理纳米科学奖(专门表彰开创性研究的国际大奖))。第一台原子力显微镜(年)(图片来自网络)新型的原子力显微镜(图片来自网络)单个鼠微小病毒(MVM)粒子的原子力显微镜图像及测量数据(图片来自网络)·“异想”之念运用原子力显微镜、扫描隧道显微镜技术虽然已可拍摄到单个原子的图像(原子直径约0.1纳米)，但这些技术均要向观测目标发射电子束，这对生物样本来说仍具有较大的破坏性，且无法看到生物样本微小结构的内部。有没有更好的办法呢？美国华盛顿大学的约翰·西德斯(JohnSidles)是位比较奇怪的人，他既是医学研究员又是量子系统工程师，对量子自旋成像及计量学的实验以及为再生医学服务的量子模拟理论很感兴趣。年，西德斯正在研发对抗艾滋病毒的药物。他看到了IBM公司关于原子力显微镜的介绍。原子力显微镜利用微小悬臂来感受及放大悬臂上极尖细的探针与受测样品原子间的作用力，这一点令西德斯很感兴趣，他脑子里却“异想”出另外一个念头：能否将原子力显微镜的扫描探针显微技术与已在生物学、医学领域广泛应用的磁共振成像技术(MagneticResonanceImaging，简称MRI)(一种生物结构微米级三维成像技术)结合起来，以得到生物结构更高分辨率的三维图像？他开创性地提出了磁共振力显微镜(MagneticResonanceForceMicroscopy，简称MRFM)的理论概念并实现了原理性的工作。西德斯邀请IBM公司的丹尼尔鲁格(DanielRugar)帮助设计，合作开发磁共振力显微镜。西德斯、鲁格以及约翰·马明(JohnMamin)等人设法将样品放置在极小的悬臂尖端，依据在设定实验条件下探测到的极小磁力数据创建出生物结构的纳米级三维图像。年，世界首台磁共振力显微镜在IBM公司实验室开始工作，在后续的改进中，分辨率不断提高。约翰西德斯(JohnSidles)、丹尼尔鲁格(DanielRugar)、约翰马明(JohnMamin)(图片来自网络)磁共振力显微镜原理示意图(除外部磁场外，样品还处于磁场螺线管的交变磁场中)(图片来自网络)磁共振力显微镜同时具备了磁共振成像的三维探测能力与扫描探针显微术的纳米分辨能力，信噪比极高。年，鲁格等人利用这种技术成功拍摄到了单个电子的自旋。磁共振力显微镜单个电子自旋实验示意图(图片来自网络)随着灵敏度及空间分辨率的不断提高，磁共振力显微镜不仅用于生物分子三维结构的测定，还在多个研究领域发挥了重要作用。年1月，美国IBM实验室用磁共振力显微镜首次拍摄到单个烟草花叶病毒粒子的三维结构图像(分辨率4纳米)。病毒样本放置在显微镜的超小悬臂上(用于调节样本与磁体的位置)，在极低温度条件下，用激光测出不同磁场值下悬臂产生的瞬间振动，通过病毒样本在磁场中的位置移动生成清晰的三维图像。他们的研究成果发表在《美国国家科学院院刊》上(鲁格、马明获《美国国家科学院院刊》年度的科扎雷利奖(CozzarelliPrize)；鲁格、马明、西德斯年分享了核磁共振领域的最高奖项之一——冈瑟·劳金奖(GüntherLaukienPrize)。对研究分子结构与蛋白质相互作用的结构生物学家来说，磁共振力显微镜是十分得力的工具，特别是对一些不能结晶，无法利用X射线进行衍射分析的生物样本来说，磁共振力显微镜极为有效，不仅可以看到构成基本DNA结构的成分，还能拍摄出生物分子的互动图像。鲁格(右一)、马明(中)与磁共振力显微镜(图片来自网络)(A-C)磁共振力显微镜拍摄到的烟草花叶病毒粒子；(D)病毒片段的水平切片；(E)同一区域的扫描电子显微照片；(F)吸附在背景层表面的两个病毒粒子；(G)数据修正后重建的两个病毒粒子图像(图片来自网络)·冷冻一下？再举一个“异想”的例子。电子显微镜在材料科学领域的应用广泛，而生物学领域的应用遇到一些困难。这是因为电子显微镜的电子束会造成含水生物样品的损伤(被电子束杀死或在真空条件下脱水而死)，而生物样品不含水份无法稳定，如用脱水干燥工艺来制作样品的话则会导致电子显微镜的成像分辨率大大降低(降至~1.5纳米)，加之电子显微镜只能在高真空条件下工作。如何才能让电子显微镜能直接观察到真实的含水生物样品呢？美国加州大学的罗伯特·格莱瑟(RobertGlaeser)和肯尼斯泰勒(KennethTaylor)年时“异想”出一个新思路：通过“冷冻”的方法来降低电子束对含水生物样品分子结构的辐照损伤，同时还可避免生物样品在高真空环境中的脱水，从而获得含水生物样品的电子显微镜高分辨率成像。这可以说是冷冻电子显微镜最初的设想，他们也进行了一些相关的实验，但真正实现冷冻电子显微镜这个设想还有很多难关需要攻克。约20年后，他们的这个“异想”在多位大伽的努力下才变成了现实！罗伯特格莱瑟(RobertGlaeser)(图片来自网络)年，瑞士洛桑大学的雅克·杜波切特(JacquesDubochet)团队开发出了实用的、可将生物样品速冻于玻璃态冰中的方法和装置，能成功地生物样品进行“冷冻保鲜”。杜波切特的生物样品玻璃化法示意图(图片来自网络)年至年期间，美国哥伦比亚大学的乔希姆·弗兰克(JoachimFrank)团队开发出一种新的图像处理技术——称为“单颗粒重构(Single-ParticleReconstruction)”技术，可有效地降低图像中的噪音，将电子显微镜下获得的模糊的二维图像分析合成为清晰的三维结构。用单颗粒重构技术获得的烟草花叶病毒三维结构(图片来自网络)苏格兰的理查德·亨德森(RichardHenderson)在“电子显微三维重构技术(阿伦克鲁格提出的)”基础上开创了二维电子晶体学的三维重构技术。年，他应用该技术技术解析出一个膜蛋白的三维结构(原子级分辨率)，他还为冷冻电子显微镜技术的发展提供了很多理论分析的依据及关键建议。亨德森年解析出的一个膜蛋白三维结构(图片来自网络)杜波切特、弗兰克以及亨德森的贡献使冷冻电子显微镜(Cryo-ElectronMicroscopy，简称Cryo-EM)得以成为实用的技术。随着相关的计算机控制、探测、图像处理等技术的发展，冷冻电子显微镜的分辨率达到了0.2~0.3纳米，突破了X射线晶体衍射和核磁共振技术的局限，成为研究蛋白及病毒结构、分布与功能的重要手段，使解析高分辨率生物大分子复合物的三维结构变得更为容易，对推动结构生物学、医药学等学科的发展产生了巨大影响(这三位物理学家获得了年的诺贝尔化学奖，被趣称为是发给了物理学家的诺贝尔化学奖，奖励他们帮助了生物学家)。乔希姆·弗兰克(JoachimFrank)、雅克·杜波切特(JacquesDubochet)、理查德亨德森(RichardHenderson)(图片来自网络)冷冻电子显微镜(年、年)(图片来自网络)冷冻电子显微镜下的寨卡(Zika)病毒粒子三维结构图像重建(年)(图片来自网络)年2月，中国西湖大学的施一公团队用冷冻电子显微镜技术成功解析新冠病毒受体血管紧张素转换酶2（ACE2）的全长结构(图片来自网络)上述几个因“异想”而产生、发展的新型电子显微技术，令人不得不对这些敢于“异想”的人由衷地表示敬佩。科技的发展并没有尽头，电子显微镜的优势虽然明显，却也存在着本质的缺陷：无法用于活细胞的观察以及获取生物活动的动态信息。光学显微镜的“阿贝极限”究竟有没有可能真正被突破呢？科学家们仍在努力！来源：中科院高能所编辑：tzy

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