导读

基因测序系列，将聚焦基因测序设备，系统分析一代、二代、三代基因测序设备的技术原理，代表厂家，仪器特点以及未来趋势。本篇从技术原理、产品特点、公司现状、市场等方面，深入分析二代测序的三大代表技术：Roche公司的技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术。

第一代测序技术的主要特点是测序读长可达bp，准确性高达99.%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周。

Roche公司技术

1、技术原理

Roche测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。它的主要测序原理如下图abc所示。

（1）DNA文库制备

利用超声或者氮气喷雾法将待测DNA打断成-bp长的小片段，并在片段两端加上不同接头分A、B两种，即各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp(TCAG)的“key”碱基构成，其中B接头的5’端带有生物素（Biotin）标记，用于磁珠纯化步骤。待测DNA进行PCR扩增，并构建单链DNA文库（图1.a）。

（2）emPCR（乳液PCR)

测序的一个关键步骤，将富集到的文库与直径约28um的测序磁珠、各反应物混合，加入特定的矿物油和表面活性剂，再利用振荡器剧烈振荡，使反应体系形成油包水（water-in-oil）的稳定乳浊液。在理想条件下，每一个液滴，或称微反应器中将只包含一个磁珠和一条单链DNA,通过控制该步骤的条件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方个理想的微反应器。经过PCR扩增后，每一个磁珠上将形成密集的DNA簇，这些DNA序列完全相同，即可用于后续的步骤。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段依然结合在磁珠上。（图1.b）

（3）焦磷酸测序

测序的反应板称为PTP，这种平板上特制有许多直径约为44um的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，以便检测接下来的测序反应过程。

测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应。如果dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团，并发出荧光，每一种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同。同时由PTP板另一侧的CCD照相机记录，通过光信号处理而获得最终的测序结果。

图1.Roche测序系统原理[1]

由于测序技术中，每个测序反应都在PTP板上独立的小孔中进行，因而能大大降低相互间的干扰和测序偏差。技术最大的优势在于其能获得较长的测序读长，当前技术的平均读长可达bp，并且其准确性仍能达到99%以上;但它最主要的一个缺点是无法准确测量同聚物的长度，如当序列中存在类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，而所加入的T的个数只能通过荧光强度推测获得，这就有可能导致结果不准确。

2、代表厂家及仪器特点

生命科学公司于年推出的GS20测序仪，是第一个商品化的NGS平台，具有里程碑式的意义。同年获得华尔街生物技术医药类的创新金奖。

年，罗氏诊断（RocheDiagnostics）以1.55亿美元收购了，并推出了一系列性能更优的NGS系统，极大的提升测序通量和准确性，也进一步增加了测序读长。虽然罗氏具有读长优势，由于在测序系统在通量、准确性、以及成本等方面缺乏竞争力，因此罗氏在年底终止了NGS测序相关的业务。

illumina公司Solexa，Hiseq技术技术原理

1、Solexa，Hiseq技术原理

Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器，这两个系列的技术核心原理是相同的。它的测序过程主要分为以下4步，如图2.

（1）DNA待测文库构建

利用超声波把待测的DNA样本打断成-bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头（P7/P5，记与P7/P5互补的接头单链为P7’/P5’），进行PCR扩增后构建出单链DNA文库。

（2）桥式PCR扩增与变性

文库中的DNA都为一端P7一端P5’，或者一端P7’一端P5的单链，稀释到合适浓度加入到流通池（Flowcell）。流通池表面所固定的接头为间隔排列的P5、P7，DNA单链片段通过互补接头结合在流通池上，因为文库稀释后浓度足够低，可以认为文库片段均匀的结合在流通池表面，每个片段结合的位置相距足够远。流通池上接头根据结合的互补链扩增形成双链，洗去未固定的的互补单链，留下两端分别为P7，P5’和P5、P7’的单链，该单链未固定一侧的P5’和P7’可分别与两侧的接头P5和P7结合形成桥，互补扩增生成单链后，经变性成单链，再次形成桥，成为下一轮扩增的模板继续扩增反应。在反复进行30轮扩增，每个单分子得到了倍扩增，成为单克隆"DNA簇群”，如图所示。进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。

（3）测序

测序反应采用其专利的“可逆性末端终结反应”，四种碱基分别标记四种不同荧光，每个碱基末端被保护基团封闭，单次反应只能加入一个碱基，未使用的游离dNTP，用激光激发荧光信号，经过扫描，读取该次反应颜色后，该保护基团被除去，下一个反应可继续进行，如此反复，得出碱基的精确序列。Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换，目前它的测序错误率在1%-1.5%之间。

图2.Illumina测序仪系统技术原理[2]

（4）流通池（Flowcell）结构

Flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，当文库建好后，这些文库中的DNA在通过flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个channel，每个channel的表面都附有很多P5、P7间接排布的接头，DNA片段配对固定于流通池之上。

图3.流通池横截面[3]

2、代表厂家及仪器特点

6年,Solexa公司推出了自己的NGS系统——GenomeAnalyzer,简称GA，这套系统具有高通量、低错误率、低成本、应用范围广等优点。

年，Illumina公司以6亿美元的高价收购了Solexa，使GA得以商品化。随后于年，Illumina公司推出HiSeq系列，该系列非常适合全基因组、转录组测序。

年，Illumina公司推出MiSeq系列，体积和通量更小、价格低，便于扩增子和细菌样本测序，更加适合临床使用。且易于操作，体积小巧，可进行双向扩增子测序，样本制备简易，具有2xbp的读长，实现高达15Gb的产出。缺点是不适合WGS和WES测序。

年1月，Illumina宣布推出HiSeqXTen测序平台，适用于大规模人群分析，包括10个可平行测序的超高通量测序仪，（1百万美元/台，成套平台至少10台起买）此系统号称为首个将人类全基因组测序成本降至美元或更低的测序平台。该系列仪器成本低，灵活性高，通量大。缺点是读长短和对每个测序反应产生的大量数据的存储和分析系统不足。

年Illumina公司推出Nextseq，是一款高通量台式测序仪，其大小与Miseq相当，性能却与Hiseq相当，适合临床应用。运行时间短、测序质量高，全基因组、外显子和RNA测序可在一个平台完成，改良型技术效率更高。

年Illumina公司又发布一款小型桌面式测序仪MiniSeq，体积比Miseq仪器小44%，运行时间短、选择灵活，测序质量更高。缺点是不适合WGS和WES测序。

年是Illumina公司又推出NovaSeq系列，为可扩展的高通量测序仪，该系列有0和两种系统，并且具有可选择的不同数量流动槽芯片的测序模式。可扩展、通量高、选择灵活、簇密度和产出更高。使用范围广，Illumina公司其他类型仪器的测序领域均可覆盖。

图4.Illunima各类仪器性能指标（数据来源Illunima

转载请注明:http://www.aideyishus.com/lkcf/4214.html